亚洲国产成人久久精品一区-欧美日韩成人观看-一二三四的视频日本电影-日本午夜视频@一级-久久久久久免费观看视频-国产午夜一级鲁丝片-91亚洲在线播放

　　一、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介

　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA、RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等，理想的轉(zhuǎn)染方法是具有高轉(zhuǎn)染效率、對(duì)細(xì)胞毒性作用小等。其中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是常用的簡(jiǎn)便轉(zhuǎn)染方法。

　　脂質(zhì)體(liposome)轉(zhuǎn)染方法的原理在于，陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹，形成DNA-脂復(fù)合體，被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附。再通過膜的融合或細(xì)胞的內(nèi)吞作用，偶爾通過直接滲透作用，將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，形成包涵體或進(jìn)入溶酶體。當(dāng)DNA從包涵體內(nèi)釋放后，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。

　　二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟(以6孔板為例)

　　1 轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于6孔板，5×104每孔，第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到60%-70%每孔。

　　2 轉(zhuǎn)染前半小時(shí)將完全培養(yǎng)基換無血清培養(yǎng)基1.9 ml。

　　3 A液：RNA100pmol/DNA 2μg(根據(jù)核酸類型不同，用量不同)加入50 ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜置5min。

　　4 B液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體5ul 加入50 ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜置5min。

　　5 B液加入到A液中，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

　　6 將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細(xì)胞中，邊滴加邊前后左右十字交叉輕輕搖晃。

　　7 孵箱37℃培養(yǎng)4~6h，然后將無血清培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

　　8 mRNA 水平的檢測(cè)：在轉(zhuǎn)染后24-48h后，用Real-time PCR的方法在mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。

　　9 蛋白水平的檢測(cè)：在轉(zhuǎn)染后48-72h后，用Western-blot或免疫組化的方法在蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。