【使用方法】

動(dòng)物 EdU 注射

對(duì)于小鼠，可以按照 10-200mg/kg 的用量，把 EdU 用 PBS 配制成一定濃度，腹腔注射、特定組 織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動(dòng)物的種類(lèi)、體重和使用方式有關(guān)，可 以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時(shí)建議對(duì) EdU 的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使 50mg/kg 的濃度進(jìn)行測(cè)試。

注射方式:依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾靜脈注射等，其中以腹腔 注射為多。6 小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，快速處死小鼠，取出所需組織，按照 常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU 標(biāo)記的時(shí)候也可參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。建議任何實(shí) 驗(yàn)均可取小腸組織檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，小腸上皮組織細(xì)胞增殖快，成年小鼠 EdU 注射 6 小時(shí)后 即可檢測(cè)到陽(yáng)性信息，可用作陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

切片處理

切片前處理：組織器官最好進(jìn)行清洗，以去除血液、組織中殘留的EdU，降低背景。

切片厚度：3-10μm 為宜，切片過(guò)厚可能會(huì)影響切片背景。

切片后處理：

石蠟切片脫蠟：二甲苯脫蠟 2 次，15 分鐘/次，乙醇梯度 (100%，95%，85%，75%) 洗脫各一次， 5 分鐘/次，去離子水洗脫 1 次。

冰凍切片處理：室溫放置 30 分鐘后，固定 10 分鐘，PBS 清洗 3 次，每次 5 分鐘。

Edu 反應(yīng)

按照 PB:CU:綠色色原：AC=860:40:1:100 的比列配制 EdU 反應(yīng)液。  (反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用)

每片組織滴加 50-100 μl 的 EdU 染色反應(yīng)液，室溫避光孵育 15 分鐘，棄染色反應(yīng)液，PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

其他染色

客戶可以根據(jù)需要進(jìn)行細(xì)胞表面或者細(xì)胞內(nèi)抗原染色。

DAPI 染色

每片組織加入 50-100ul DAPI 染色液，染色 15 分鐘，PBS 洗脫三次，每次 5 分鐘。

圖像拍照

染色完成后建議立刻觀察，使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡采集圖像，本試劑盒熒光染料 AF488 對(duì)應(yīng)的光譜特性為 Ex/Em：491 nm/516 nm (綠色) ；DAPI 染色液對(duì)應(yīng)的光譜特性為 Ex/Em：

358 nm/461 nm (藍(lán)色) 。

【注意事項(xiàng)】

1. 對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞，具體 EdU 使用濃度、孵育時(shí)間隨樣品以及研究目的的不同，可進(jìn)行 適當(dāng)調(diào)整。

2. 部分組織細(xì)胞增殖速度緩慢，為了排除造模效果不佳等因素，建議選增殖快的組織樣品作 為參照樣本 (如腸道組織)。

3. 如果背景顏色過(guò)深，可能是實(shí)驗(yàn)中洗滌不充分、組織樣品固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、固定液殘余導(dǎo)致。

4. 催化劑 AC 顏色發(fā)生輕微變化，點(diǎn)擊反應(yīng)催化體系依舊能夠正常進(jìn)行，如呈現(xiàn)棕色，表明 該組分已失效，請(qǐng)棄用。

5. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性手套。