【產(chǎn)品信息】

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)	規(guī)格	有效期
DiO 綠光細(xì)胞膜染色試劑盒	HK2071	100T	一年

【產(chǎn)品簡介】

DiO（又稱DiOC₁₈(3)），其化學(xué)全名為3-十八烷基-2-[3-(3-十八烷基-2(3H)-苯并惡唑-2-亞基)-1-丙烯-1-基]苯并惡唑高氯酸鹽，是一種脂溶性、長鏈二烷基碳菁類熒光染料。該染料的分子量為933.87 g/mol，具有高度的脂溶性，常用于細(xì)胞膜及其他脂質(zhì)生物結(jié)構(gòu)的標(biāo)記。DiO進(jìn)入細(xì)胞膜后，通過橫向擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)雙層脂質(zhì)膜的廣泛染色，形成連續(xù)的細(xì)胞膜熒光標(biāo)記，便于細(xì)胞形態(tài)和膜動(dòng)態(tài)的觀察。在脂質(zhì)環(huán)境中與細(xì)胞膜結(jié)合后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，DiO在激發(fā)光照射下可發(fā)出橙綠色熒光，激發(fā)波長為484 nm，發(fā)射最大波長為501 nm。其性能使其成為活細(xì)胞和固定細(xì)胞膜成像的理想熒光探針。傳統(tǒng)檢測中，可利用標(biāo)準(zhǔn)的FITC濾光片進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射信號(hào)的檢測。DiO染色具有良好的細(xì)胞兼容性，不會(huì)顯著影響細(xì)胞的存活率，因此廣泛應(yīng)用于細(xì)胞追蹤、外泌體示蹤以及膜動(dòng)力學(xué)研究。由其優(yōu)異的脂質(zhì)親和性和穩(wěn)定的熒光性能，使其成為細(xì)胞膜成像和示蹤研究中的重要工具。

本產(chǎn)品DiO 綠光細(xì)胞膜染色試劑盒，集成了優(yōu)化的DiO 細(xì)胞膜染色緩沖液，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、穩(wěn)定且高效的細(xì)胞膜熒光標(biāo)記，極大提升實(shí)驗(yàn)的效率與熒光的亮度與穩(wěn)定性。

【產(chǎn)品組成】

產(chǎn)品貨號(hào)	主要成分	產(chǎn)品規(guī)格
HK2071A	DiO 綠光細(xì)胞膜探針	40 μL
HK2071B	DiO 細(xì)胞膜染色緩沖液	10 mL

【儲(chǔ)存與運(yùn)輸】

干冰運(yùn)輸；-20℃避光保存，探針避免反復(fù)凍融，有效期 6 個(gè)月。

【使用方法】

1. DiO染色工作液配制：

1.1. 將DiO細(xì)胞膜綠色熒光探針與染色緩沖液以 1:250 比例混合稀釋，配制成DiO染色工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）；注意，DiO探針稀釋比可根據(jù)具體情況在 1:250-1:500 進(jìn)行調(diào)整，以獲得最佳染色效果。

2. 懸浮活細(xì)胞染色：

2.1. 收集懸浮細(xì)胞，以 500-1000 g室溫離心 3-5 min，去除細(xì)胞上清；

2.2. 使用DiO染色工作液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度在 1-2×10⁶個(gè)/mL；

2.3. 置于 37℃避光孵育 5-20 min；建議根據(jù)具體細(xì)胞調(diào)整染色時(shí)間，以獲得最佳染色效果；

2.4. 孵育結(jié)束后，500-1000 g室溫離心 3-5 min，吸除DiO染色工作液；

2.5. 用 37℃預(yù)熱的PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，500-1000 g離心 3-5 min，去除上清；

2.6. 重復(fù) 2.5 步驟一次；

2.7. 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)移至多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿或者載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。DiO最大激發(fā)波長 484 nm，最大發(fā)射波長 501nm。

3. 貼壁活細(xì)胞染色（6 孔板為例）：

3.1. 將細(xì)胞提前以一定密度種植于 6 孔板中；

3.2. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞 2 次。加入 1 mL DiO染色工作液（其他規(guī)格孔板，

視情況調(diào)整，保證染料覆蓋細(xì)胞）；

3.3. 置于 37℃避光孵育 5-20 min，吸除DiO染色工作液。建議根據(jù)具體細(xì)胞調(diào)整染色時(shí)間，以獲得最佳染色效果；

3.4. 用 37℃預(yù)熱的PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞 1-2 次；

加入 37℃預(yù)熱的PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察。DiO最大激發(fā)波長 484 nm，最大發(fā)射波長501nm。

4. 固定的貼壁細(xì)胞染色：

4.1. 樣本前處理：

對(duì)于細(xì)胞：去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌 1-2 次。加入 4%多聚甲醛固定液，室溫固定 10 min。吸除固定液，用PBS洗滌 2-3 次；

4.2. 加入 0.1-0.5% Triton-100（PBS配制）處理細(xì)胞，室溫通透 10 min；吸除通透液，用PBS洗滌 2-3次；

4.3. （可選，免疫熒光標(biāo)記）按照免疫熒光染色的方法進(jìn)行抗體的孵育或其他染料進(jìn)行染色。注意抗體孵育過程中的封閉液、抗體稀釋液、洗滌液等不能含有去垢劑；

4.4. 加入適量體積的DiO染色工作液覆蓋細(xì)胞，37℃避光孵育 5-20 min，吸除DiO染色工作液。建議根據(jù)具體細(xì)胞樣本調(diào)整染色時(shí)間，以獲得最佳染色效果；

4.5. 細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌 2-3 次，然后置于熒光顯微鏡觀察（細(xì)胞需以適量PBS覆蓋）。DiO最大激發(fā)波長484nm，最大發(fā)射波長 501nm。

5. 外泌體熒光標(biāo)記：

5.1. 將提取的外泌體沉淀，用適量DiO染色工作液重懸；

5.2. 將樣品置于 37℃避光孵育 30 min；

5.3. 用 10 倍體積PBS稀釋樣品體積（可選）；

5.4. 按照之前提取獲得外泌體的方案，再一次提外泌體，以去除多余的染料；

5.5. 收集的外泌體沉淀，用PBS重懸，得到DiO標(biāo)記的外泌體?？捎糜谙鄳?yīng)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，例如細(xì)胞攝取。

【注意事項(xiàng)】

1. 熒光染料存在淬滅問題，請(qǐng)注意避光以減緩熒光猝滅。

2. 實(shí)驗(yàn)過程中請(qǐng)避免使用含有甘油或其它有機(jī)物的試劑，否則會(huì)影響染色效果。

3. 當(dāng)需要固定操作時(shí)，樣品宜在 4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，其他不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?huì)導(dǎo)致熒光背景高。

4. 由于細(xì)胞敏感性和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，探針的稀釋比和孵育時(shí)間需根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整。

5. 為了您的健康和安全，操作時(shí)請(qǐng)穿好實(shí)驗(yàn)服、戴好手套。

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