服務(wù)介紹：

　　原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。

原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 脫蠟至水

依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-二甲苯Ⅲ15 min-無水乙醇10 min-90%酒精10 min-80%酒精10 min -70%酒精10 min -純水沖洗。

2. 酶修復(fù)

細(xì)胞樣本：等待切片完全干燥后，用組畫筆（推薦HKR14P原位雜交專用組畫筆）畫出大小合適的疏水圈，在原位雜交儀中或濕盒中水平放置切片。將100ul蛋白酶K修復(fù)液(1X)滴于組織上，37℃孵育10min，純水沖洗終止反應(yīng)。

冰凍切片：細(xì)胞樣本：等待切片完全干燥后，用組畫筆（推薦HKR14P原位雜交專用組畫筆）畫出大小合適的疏水圈，在原位雜交儀中或濕盒中水平放置切片。將100ul蛋白酶K修復(fù)液(1X)滴于組織上，37℃孵育20min（冰凍切片），純水沖洗終止反應(yīng)。

石蠟切片：將裝入玻片的玻片架放入修復(fù)槽，倒入1x檸檬酸6.0修復(fù)液（樣本區(qū)域須被浸沒），蓋上蓋子，用膠帶紙封住，放入微波爐中，中火8min，停8min，中低火8min。自然冷卻降溫后，用3%雙氧水封閉15min。

3. 封閉

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul封閉液，37℃孵育30min，洗滌1次，每次5min。洗滌步驟：將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（樣本區(qū)域須被浸沒），置于搖床上5min，轉(zhuǎn)速為60。

4. 探針雜交

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的探針，37℃孵育3h或過夜，注意保持濕度以防干片。洗滌5次，每次5min。洗滌步驟：將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（樣本區(qū)域須被浸沒），置于搖床上5min，轉(zhuǎn)速為60。

5. 探針放大

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的放大探針，37℃孵育1.5h，注意保持濕度以防干片。洗滌5次，每次5min。洗滌步驟：將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（樣本區(qū)域須被浸沒），置于搖床上5min，轉(zhuǎn)速為60。

6. HRP-鼠抗地高辛

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的HRP-鼠抗地高辛（1x），37℃濕盒孵育40min；洗滌5次，每次5min。洗滌步驟：將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（樣本區(qū)域須被浸沒），置于搖床上5min，轉(zhuǎn)速為60。

7. 顯色

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的TSA顯色液，室溫孵育10min。純水沖洗，終止反應(yīng)。

8. 抗體洗脫

將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入抗體洗脫液（樣本區(qū)域須被浸沒），室溫孵育10min，純水洗5次，每次5min。

9. 加一抗

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul按1:200稀釋的抗體工作液，4℃孵育過夜。PBS緩沖液洗滌5次，每次5min。

10. 加二抗

甩干切片上的液體，每張切片滴加即用型POLY-HRP羊抗兔鼠通用二抗，室溫孵育1h。PBS緩沖液洗滌5次，每次5min。

11. 顯色

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的TSA顯色液，室溫孵育10min。純水沖洗，終止反應(yīng)。

12. DAPI染核

每張切片滴加50ul DAPI染液，避光孵育10min，純水沖洗后滴加封片劑封片。