【產(chǎn)品信息】

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號	規(guī)格	有效期
DiO 綠光細胞膜染色試劑盒	HK2071	100T	一年

【產(chǎn)品簡介】

DiO（又稱DiOC₁₈(3)），其化學(xué)全名為3-十八烷基-2-[3-(3-十八烷基-2(3H)-苯并惡唑-2-亞基)-1-丙烯-1-基]苯并惡唑高氯酸鹽，是一種脂溶性、長鏈二烷基碳菁類熒光染料。該染料的分子量為933.87 g/mol，具有高度的脂溶性，常用于細胞膜及其他脂質(zhì)生物結(jié)構(gòu)的標記。DiO進入細胞膜后，通過橫向擴散實現(xiàn)雙層脂質(zhì)膜的廣泛染色，形成連續(xù)的細胞膜熒光標記，便于細胞形態(tài)和膜動態(tài)的觀察。在脂質(zhì)環(huán)境中與細胞膜結(jié)合后，熒光強度顯著增強，DiO在激發(fā)光照射下可發(fā)出橙綠色熒光，激發(fā)波長為484 nm，發(fā)射最大波長為501 nm。其性能使其成為活細胞和固定細胞膜成像的理想熒光探針。傳統(tǒng)檢測中，可利用標準的FITC濾光片進行激發(fā)和發(fā)射信號的檢測。DiO染色具有良好的細胞兼容性，不會顯著影響細胞的存活率，因此廣泛應(yīng)用于細胞追蹤、外泌體示蹤以及膜動力學(xué)研究。由其優(yōu)異的脂質(zhì)親和性和穩(wěn)定的熒光性能，使其成為細胞膜成像和示蹤研究中的重要工具。

本產(chǎn)品DiO 綠光細胞膜染色試劑盒，集成了優(yōu)化的DiO 細胞膜染色緩沖液，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、穩(wěn)定且高效的細胞膜熒光標記，極大提升實驗的效率與熒光的亮度與穩(wěn)定性。

【產(chǎn)品組成】

產(chǎn)品貨號	主要成分	產(chǎn)品規(guī)格
HK2071A	DiO 綠光細胞膜探針	40 μL
HK2071B	DiO 細胞膜染色緩沖液	10 mL

【儲存與運輸】

干冰運輸；-20℃避光保存，探針避免反復(fù)凍融，有效期 6 個月。

【使用方法】

1. DiO染色工作液配制：

1.1. 將DiO細胞膜綠色熒光探針與染色緩沖液以 1:250 比例混合稀釋，配制成DiO染色工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）；注意，DiO探針稀釋比可根據(jù)具體情況在 1:250-1:500 進行調(diào)整，以獲得最佳染色效果。

2. 懸浮活細胞染色：

2.1. 收集懸浮細胞，以 500-1000 g室溫離心 3-5 min，去除細胞上清；

2.2. 使用DiO染色工作液重懸細胞，使細胞密度在 1-2×10⁶個/mL；

2.3. 置于 37℃避光孵育 5-20 min；建議根據(jù)具體細胞調(diào)整染色時間，以獲得最佳染色效果；

2.4. 孵育結(jié)束后，500-1000 g室溫離心 3-5 min，吸除DiO染色工作液；

2.5. 用 37℃預(yù)熱的PBS或細胞培養(yǎng)基重懸細胞，500-1000 g離心 3-5 min，去除上清；

2.6. 重復(fù) 2.5 步驟一次；

2.7. 流式細胞儀上機檢測，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)移至多孔板、細胞培養(yǎng)皿或者載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。DiO最大激發(fā)波長 484 nm，最大發(fā)射波長 501nm。

3. 貼壁活細胞染色（6 孔板為例）：

3.1. 將細胞提前以一定密度種植于 6 孔板中；

3.2. 吸除細胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞 2 次。加入 1 mL DiO染色工作液（其他規(guī)格孔板，

視情況調(diào)整，保證染料覆蓋細胞）；

3.3. 置于 37℃避光孵育 5-20 min，吸除DiO染色工作液。建議根據(jù)具體細胞調(diào)整染色時間，以獲得最佳染色效果；

3.4. 用 37℃預(yù)熱的PBS或細胞培養(yǎng)基，洗滌細胞 1-2 次；

加入 37℃預(yù)熱的PBS或細胞培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察。DiO最大激發(fā)波長 484 nm，最大發(fā)射波長501nm。

4. 固定的貼壁細胞染色：

4.1. 樣本前處理：

對于細胞：去除細胞培養(yǎng)基，PBS洗滌 1-2 次。加入 4%多聚甲醛固定液，室溫固定 10 min。吸除固定液，用PBS洗滌 2-3 次；

4.2. 加入 0.1-0.5% Triton-100（PBS配制）處理細胞，室溫通透 10 min；吸除通透液，用PBS洗滌 2-3次；

4.3. （可選，免疫熒光標記）按照免疫熒光染色的方法進行抗體的孵育或其他染料進行染色。注意抗體孵育過程中的封閉液、抗體稀釋液、洗滌液等不能含有去垢劑；

4.4. 加入適量體積的DiO染色工作液覆蓋細胞，37℃避光孵育 5-20 min，吸除DiO染色工作液。建議根據(jù)具體細胞樣本調(diào)整染色時間，以獲得最佳染色效果；

4.5. 細胞經(jīng)PBS洗滌 2-3 次，然后置于熒光顯微鏡觀察（細胞需以適量PBS覆蓋）。DiO最大激發(fā)波長484nm，最大發(fā)射波長 501nm。

5. 外泌體熒光標記：

5.1. 將提取的外泌體沉淀，用適量DiO染色工作液重懸；

5.2. 將樣品置于 37℃避光孵育 30 min；

5.3. 用 10 倍體積PBS稀釋樣品體積（可選）；

5.4. 按照之前提取獲得外泌體的方案，再一次提外泌體，以去除多余的染料；

5.5. 收集的外泌體沉淀，用PBS重懸，得到DiO標記的外泌體。可用于相應(yīng)的后續(xù)實驗，例如細胞攝取。

【注意事項】

1. 熒光染料存在淬滅問題，請注意避光以減緩熒光猝滅。

2. 實驗過程中請避免使用含有甘油或其它有機物的試劑，否則會影響染色效果。

3. 當需要固定操作時，樣品宜在 4%多聚甲醛中進行固定，其他不適當?shù)墓潭ㄒ簳?dǎo)致熒光背景高。

4. 由于細胞敏感性和實驗?zāi)康牡牟煌结樀南♂尡群头跤龝r間需根據(jù)實際情況適當調(diào)整。

5. 為了您的健康和安全，操作時請穿好實驗服、戴好手套。

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